Abejas del Bio Bio
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PROYECTO SEMEN IN VITRO
proyecto de crioconservación de semen zánganos en chile

La crioconservación de espermatozoides de Apis mellifera en Chile.

Por Ricardo Acuña, experto en inseminación instrumental de abejas reinas.

La primera etapa del proyecto de crioconservación de espermios de zánganos de Apis mellífera en Chile se inició el 01 de Julio de 2013 y terminó el 28 de Febrero de 2017. En su etapa inicial se partió  efectuando un análisis morfológico de los espermatozoides de zánganos para conocer su estructura molecular, sus dimensiones, en definitiva, saber qué tipo de célula se tenía que congelar. Una vez teniendo claro el tipo de célula a la cual el equipo de investigadores se enfrentaba,  se procedió analizar el medio por el cual los espermios eran trasladados desde Los Angeles a Santiago. Se analizaron varias recetas de soluciones salinas o buffer, llegando a la conclusión, que la más efectiva y que aseguraba el mayor número de espermios vivos, era la utilizada desde siempre por Abejas del Bio Bío.

Una solución salina o buffer para inseminación de abejas reinas es utilizada en todo el proceso de inseminación que va desde la cosecha del semen, almacenamiento del semen en pajuelas plásticas o de vidrio, inseminación de las abejas reinas vírgenes e incluso para el lavado de los distintos equipos y accesorios que se manejan en el uso de ésta técnica. Lo interesante es que este mismo buffer podía ser utilizado para apoyar el proceso de crioconservación de  los espermatozoides de zánganos Apis mellifera.

Una vez,  sabiendo ya el tipo de célula, el líquido que los almacenaba y trasladaba;  se procedió a trabajar en distintas recetas de soluciones crioprotectoras que aseguraran la no destrucción de las paredes celulares de los espermios por los micro hielos que se producían en la crio conservación  y que se harían efectivos al momento de la descongelación de las células. Un ejemplo muy didáctico de este fenómeno es cuando usted saca de su congelador unos gramos de frambuesas que han estado congeladas por cierto período de tiempo. Una vez descongeladas estas frutas, muestran un líquido rojizo y ellas han perdido su consistencia dura. ¿Por qué sucedió esto? Porque el hielo, que son verdaderos cuchillos, rompieron todas las estructuras de las frutas, dejándolas prácticamente descuartizadas.  Esta misma situación es la que se debía evitar al momento de descongelar los espermios de zánganos, ya que estos hielos matarían a todos los espermios que habían logrado sobrevivir de su largo sueño.

Todas las pruebas para la búsqueda de la o las soluciones crioprotectoras para espermios de zánganos se realizó en laboratorio. Se hace hincapié que estas soluciones fueron determinadas exclusivamente para los espermios de zánganos de ahí la importancia de conocer su morfología previamente. Se determinó que al menos 3 de las soluciones estudiadas, tenían potencial de ser usadas en el proceso de congelamiento.  Para determinar si ellas eran efectivas, debían  pasar  dos etapas importantes.  La primera etapa  era que al momento de congelar y descongelar los espermios tenías que quedar vivos y completamente sanos en cuanto a su estructura morfológica. Y la segunda etapa, tan importante como la primera, que una vez inseminadas las abejas reinas vírgenes en terreno, éstas reinas debían generar obreras hembras. Es decir, que los espermios mantuvieran su capacidad fecundante.

Para dar respuesta a la primera etapa, se realizaron varios estudios de viabilidad espermática a través de microscopia de fluorescencia de espermatozoides de zánganos, utilizando el kit “live and dead”. De color verde los vivos y color rojo los muertos. En paralelo, se realizaron  estudios de la membrana mitocondrial (PMM). Los resultados de estos estudios, determinaron un gran éxito bajo el punto de vista de investigación académica, ya que los valores promedios obtenidos fueron por sobre el 50 %, de lo proyectado por el equipo de trabajo. Esto indicaba que por sobre el 50 % de los espermios de zánganos  congelados con nitrógeno líquido a menos 196 °C, despertaban al descongelarlos y tenían potencial para fecundar los huevos de la abeja reina. Esto último debía ser demostrado en terreno al realizar inseminaciones instrumentales con semen descongelado.

Pero antes de comentar qué pasó con la segunda etapa, es importante mencionar, que también se hicieron muchos ensayos para determinar “la receta” perfecta para descongelar y despertar al máximo de espermios sin que  se vieran afectados  en su estructura física (cabeza, colas, etc), de manera que tuvieran el potencial fecundante. De la misma manera, se había hecho anteriormente, con la “receta” para congelarlos o criopreservarlos en nitrógeno líquido. Lo que se quiere destacar con esto, es que para lograr cada paso, cada avance, cada conocimiento en el proceso de crioconservación, hubo mucho trabajo silencioso de prueba y error, para lograr todos los resultados que se están comentando en esta oportunidad en un leguaje lo más sencillo que sea posible.

Volvamos entonces, a la segunda etapa -  Las pruebas de campo. Cuando se trabaja en proyectos de investigación y desarrollo, gran parte de las universidades y centros de investigación se quedan con los méritos de alcanzar “las metas académicas” y estos resultados la mayoría de las veces, no salen de las paredes de sus laboratorios y se dan por terminado y cumplidos los proyectos que fueron financiados por fondos públicos. Nuestra empresa, teniendo una mirada empresarial y con una clara visión hacia resultados aplicables en el sector apícola, siempre tuvo atenta a propiciar resultados en terreno. Esto explica el por qué se realizaron distintos ensayos con las “recetas de crioconservación y descongelación” en abejas reinas, simulando lo que  hacía permanentemente  la empresa con semen fresco. Fue fuerte la presión que ejerció  la empresa al equipo de investigadores para que  entregaran  resultados que se pudieran utilizar en procesos normales  y sobretodo,  comercializar pajuelas de semen congelado en el futuro. Además de constituir el primer banco de semen.

En forma paralela al estudio de crioconservación de espermatozoides de zánganos y como parte también de los objetivos del proyecto, se estudió en campo, el tiempo de maduración de las reinas vírgenes antes de ser inseminadas. Se logró determinar un tiempo de hasta 90 días, en que las reinas podían estar vírgenes antes de ser inseminadas. Su capacidad para producir crías hembras y desarrollar una colonia, no tenían mayores diferencias de una reina fecundada en forma natural. Los 90 días, fue el plazo máximo que nos permitió las condiciones climáticas imperantes en la zona en esas temporadas, estudiar la longevidad de las reinas vírgenes pre inseminado. Creemos que podemos seguir alargando este tiempo a 6 meses o más. Por ello se propone hacer un nuevo estudio de longevidad de reinas vírgenes, con las siguientes variantes de gran impacto para la apicultura: (a) Mantener reinas vírgenes con el tiempo suficiente para inseminar con semen de contra estación de Europa u otras latitudes que puedan ser autorizadas por el SAG y (b) Mantener reinas vírgenes durante otoño e invierno hasta cosechar semen de zánganos sexualmente maduros en Chile.

 En forma complementaria al estudio de longevidad de reinas vírgenes, se realizaron inseminaciones instrumentales “express”. Vale decir, se inseminaban reinas vírgenes traídas por los clientes con semen de la empresa y en el mismo día se trasladaban a los apiarios de los clientes. Más del 90 % de estás reinas, tuvieron un apego exitoso en sus nuevas familias.

En el proceso de inseminación instrumental de abejas reinas con semen congelado/descongelado, se verificó en una primera instancia, si los espermios sobrevivientes al proceso de crio, tenían la energía suficiente para emigrar desde la vagina hasta el oviducto central y luego desde allí hasta la    espermateca.

La espermateca es el órgano de almacenamiento del esperma, común en el sistema reproductor de muchos insectos y otros invertebrados; en Apis mellifera solo las reinas están equipadas de este órgano siendo funcional, en cambio en las abejas obreras es vestigial o sea lo tienen en forma rudimental no funcional, aunque puede desarrollarse según la necesidad.  La espermateca de Apis mellifera se encuentra en el abdomen, tiene forma de esfera, está  conectada al oviducto a través del doto espermático, tiene más de un milímetro de diámetro y la pared está formada por una capa de células epiteliales rodeada de una densa red de finas tráqueas. Apoyada a la superficie de a la pared están situadas las glándulas de la espermateca. Condiciones fisiológicas particulares permiten conservar por años el esperma, el cual se encuentra en un estado quiescente, con un metabolismo muy bajo manteniendo conservada su capacitad de fecundación. Las células espermáticas para sobrevivir años necesitan de oxígeno y sustancias nutritivas que son proporcionadas respectivamente por la densa red de finas tráqueas que rodea el órgano y de las glándulas de la espermateca, que secretan una solución nutritiva que además es necesaria para la activación y migración de los espermatozoides.

La espermateca de una reina virgen es totalmente transparente y de consistencia blanda, en cambio la de una reina fecundada o inseminada, pasada las 24 horas se puede ver de color gris anaranjado y con una consistencia dura.

Pasado 24 horas, de haber realizado inseminación instrumental con semen congelado/descongelado en los laboratorios de la empresa, se analizó en algunas abejas reinas, el estado de sus espermatecas, comprobando que los espermios habían recorrido exitosamente el camino desde la vagina hasta la espermateca. Este hito, constituyó un éxito sin precedentes en Chile, ya que quedaba demostrado en campo, que los espermios sobrevivían a la crioconservación y tenían la energía suficiente para hacer el largo camino hasta llegar a la espermateca. El siguiente paso era comprobar si mantenían la capacidad fecundante y con ello,  producir abejas hembras.

Es importante destacar que la abeja reina tienen dos mecanismo de reproducción.  Es la única hembra fértil que pone huevos fecundados que dan origen a abejas obreras infértiles y abejas reinas hijas   y pone huevos no fecundados que dan origen a zánganos fértiles, por un mecanismo denominado partenogénesis. 

La Partenogénesis es un concepto que se emplea en la biología para nombrar a un mecanismo reproductivo que comparten ciertas especies animales y vegetales. La partenogénesis se lleva a cabo cuando las células sexuales femeninas se dividen repetidamente sin que se hayan vinculado con anterioridad a un gameto de tipo masculino. Debido a sus características, la partenogénesis puede calificarse como una reproducción sexual de tipo monogamética (ya que cuenta con la intervención de una clase de célula sexual) o, incluso, como un mecanismo reproductivo asexual.

En el caso de las obreras y abejas reinas hijas, provienen de una reproducción sexual en donde se unen las dotaciones genéticas del  zángano padre con los de la reina madre,  produciendo una nueva combinación genética, formando cigotos diploides. Desde el punto de vista de transferencia genética, tanto las obreras y reinas hijas, son equivalente, la única diferencia, es que las primeras no tienen desarrollado sus aparatos reproductivos por la menor alimentación con jalea real en su etapa larval.

Una vez que las abejas reinas inseminadas con semen congelado/descongelado, iniciaron su postura, se esperó 9 días para determinar en forma indirecta si las larvas generadas eran hembra o machos. Una vez que la reina pone un huevo, a los tres días nace una larva y al día 9 en caso de ser obrera,  inicia el operculado (cerrado) de la celdilla. Si una vez operculada la celdilla es totalmente plana, es señal que se está frente a una hembra y si es más abultada es señal que es macho.

En los primeros días de postura de las reinas, las celdillas operculadas fueron totalmente planas, es decir, los primeros huevos fueron fecundados por espermios crio, que habían logrado tener la capacidad fecundante para ello. En los días siguientes, el ciclo de las reinas, generó celdillas operculadas más abultadas, lo que permitió concluir, que algo pasaba con los espermatozoides al interior de la espermateca de las reinas. Se abrieron algunas celdillas operculadas, y se verificó el desarrollo de abejas obreras y de unos zánganos de menor tamaño. A las obreras obtenidas de semen crio conservado, se les llamó “obreras crio” a los zánganos obtenidos de estos procesos, “zánganos crio” y luego a las reinas obtenidas “reinas crio”. Nacía desde ese momento  una nueva casta de abejas: Las “abejas crio”. En ensayos posteriores de inseminación instrumental de abejas reinas, se determinó que los espermatozoides de los “zánganos crio” mantenían la misma capacidad fecundante y características de un zángano normal, la única diferencia radicaba en el volumen de  semen producido que bordeaba en promedio a  los 0,5 microlitros a diferencia de un zángano normal que apuntaba a valores cercanos a  1,0 microlitros. 

 En los  ensayos no fue posible obtener “reinas crio” bajo los métodos de traslarve tradicionales de producción de reinas. La única forma de obtenerlas fue  rediseñando un nuevo modelo de crianza, dejando a  las propias abejas que eligieran  dentro de las larvas disponibles en el marco introducido a las futuras reinas crio.  Fue la única metodología que  permitió obtener las primeras reinas crio, obtenidas tras un largo proceso de investigación, desarrollo, mucha observación de campo, y sobre todo la visión  para cambiar de estrategia frente a las situaciones nuevas que se presentaban,  logradas con la experiencia  de trabajar toda una vida con abejas.

 

Al cierre de este proyecto FIA,  queda la satisfacción de haber logrado  todos los objetivos trazados en el programa inicial  y cumplir otros que fueron naciendo en el camino. Como gran conclusión final, es factible técnicamente, producir abejas reinas a partir de espermatozoides crioconservados a menos 196 °C  con nitrógeno líquido en Chile.

Este proyecto de crioconservación de espermios de zángano, ha abierto nuevas ventanas de exploración que pueden ser muy relevantes para la apicultura nacional e internacional. Dentro de estas ventanas de exploración, destacar el “Estudio de la partenogénesis de las abejas para desarrollar casta de abejas más eficientes para la polinización de frutas y huertos semilleros”, y el proyecto “Abejas adaptadas al cambio climático para una agricultura sustentable nacional  - VSH Chile – con fines productivos y comerciales”. Esperamos contar con financiamiento estatal y privado para ejecutarlos en el mediano plazo.

El proyecto de Crioconservación de semen de zánganos, amerita una segunda etapa de ejecución, ya que al término de él, quedan muchas interrogantes que por tiempo y recursos, no pudieron ser resueltas. Queda por estudiar: ¿Mueren los espermios en la espermateca de la reina o pierden su capacidad fecundante? Desde el momento que se insemina una reina con semen crio, ¿cuánto vive un espermio descongelado? ¿Qué características especiales tiene la espermateca de las reinas, que permite que los espermatozoides permanezcan vivos por años? Y finalmente, ¿Cómo aumentar la producción de reinas crio?

HITOS  PROYECTO CRIOPRESESERVACIÓN SEMEN DE ZÁNGANOS EN CHILE.

N° Hito

Descripción

Fecha

1

Inicio proyecto de criopreservación semen zánganos.

01 – 07- 2013

2

Obtención de buffer para manejo en fresco semen de zánganos

10 – 10 -2013

3

Descripción morfológica espermios de zánganos

20 – 12-2013

4

Determinación de  las condiciones óptimas para la criopreservación de semen de zángano. 

24 -04 - 2014

5

Creación del primer criobanco de espermios de zánganos Apis mellifera en Chile

30 – 04 -2014

6

Primeros resultados en  laboratorio de congelamiento y descongelamiento de semen de zánganos de Apis miellífera.

 

17 – 06- 2014

7

Extracción de semen en Santiago para verificar si existe alguna diferencia positiva de  congelar semen fresco versus semen despachado desde Los Angeles.

05 – 11- 2014

8

Primera inseminación abejas reinas con semen crioconservado/descongelado en base a DMSO.

28 – 11- 2014

9

Segunda inseminación   para producir reinas crío en base a DMSO.

05 – 01- 2015

10

Tercera inseminación  para producir reinas crio en base a DMSO.

13 - 11- 2015

11

Primer nacimiento de reinas crio en Chile.

14 – 12- 2015

12

Cuarta inseminación para producir reinas crio en base TEST-YOLK.

04 – 01- 2016

13

Quinta inseminación para producir reinas crio. Receta mejorada en base DMSO.

29 - 11- 2016

14

Segundo nacimiento de reinas crio en Chile.

26 - 12- 2016

15

Término proyecto criopreservación espermatozoides de zánganos.

28 – 02- 2017